摘要[目的]建立一种基于超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)快速测定野生毒蕈中6种鹅膏毒肽和鬼笔毒肽类毒素的分析方法。[方法]将采集的四川野生毒蕈子实体低温烘干，用甲醇超声提取，40℃旋转蒸发近干，加水复溶，OasisHLB固相萃取小柱净化，经WatersHSST3色谱柱分离，ESI正离子模式下多反应监测(MRM)方式分析。[结果]6种毒肽在50～1000μg/kg具有良好的线性关系，相关系数均大于0.99，方法检出限为30μg/kg。α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽、羧基三羟鬼笔毒肽在低、中、高3个浓度的平均回收率在93.1%～117.5%，变异系数(CV)在1.49%～7.77%。[结论]该方法能准确、灵敏地测定野生毒蕈中6种毒肽，适用于野生菌中毒肽毒素的测定。

　　关键词野生毒蕈;鹅膏毒肽;鬼笔毒肽;超高效液相色谱-串联质谱法

　　毒蕈即日常所说的毒蘑菇，是指不同类型的含有毒素的大型野生真菌，由于有些毒蕈在外观上与食用菌没有明显区别，导致误食毒蕈而引发中毒的事件时有发生，且在群体性食物中毒中，毒蕈中毒的致死率极高，其中肝损伤型毒蕈中毒致死率高达90%～100%[1]。据统计，我国毒蕈中毒事件中，95%是由鹅膏菌属引起的[2]。因为鹅膏菌中含有化学性质稳定且毒性极强的鹅膏多肽类毒素，该类毒肽耐高温、干燥和酸碱环境，一般的烹调加工不会破坏其毒性，不幸误食后，毒肽就会通过消化系统进入肝脏，对肝脏造成严重的损伤，最终引发多器官功能衰竭而死亡[3-5]。现阶段，国内外一般采用高效液相色谱法、高效液相色谱-飞行时间质谱法和高效液相色谱-串联质谱法检测毒肽毒素[6-11]，我国还没有检测毒肽毒素的国家标准。因此，该研究建立了一种利用超高效液相色谱-串联质谱法快速测定野生毒蕈中6种毒肽毒素的检测方法，以期为野生菌毒素检测提供一种高效的检测方法。

　　1材料与方法

　　1.1仪器UPLClclass-XEVOTQ-XS超高效液相色谱-串联质谱联用仪(美国Waters公司);3H20RI离心机(中国赫西);AE240电子天平(瑞士梅特勒);XW-80A旋涡混合器(中国HUXI);B8510E-DTH超声波清洗器(美国必能信);Mili-QIntegral3超纯水仪(美国Millipore公司);ACQUITYUPLCHSST3色谱柱(2.1mm×100mm，1.8μm，美国Waters公司)。

　　1.2试剂甲醇、乙腈、甲酸、乙酸铵、氯仿，HPLC级，美国Fisher公司。标准品:α-鹅膏毒肽(α-amanitin，纯度≥90%，瑞士Alex);β-鹅膏毒肽(β-amanitin，纯度≥90%，瑞士Alex);γ-鹅膏毒肽(γ-amaniyin，纯度≥90%，瑞士Alex);羧基三羟鬼笔毒肽(phallisacin，50μg/mL，上海安谱实验科技有限公司);羧基二羟鬼笔毒肽(phallacidin，纯度≥95%，瑞士Alex);二羟鬼笔毒肽(phalloidin，纯度≥90%，瑞士Alex)。1.3试验方法

　　1.3.1标准溶液的配制。

　　1.3.1.1α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽标准储备液的配制。分别精确称取α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟鬼笔5种标准物质1mg，精确至万分之一，甲醇定容至10mL，浓度为100μg/mL。-20℃存储。

　　1.3.1.2鹅膏毒肽和鬼笔毒肽混合标准使用液的配制。分别准确吸取1.0mLα-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽和羧基二羟鬼笔毒肽储备液以及2.0mL羧基三羟鬼笔毒肽标准溶液于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，浓度为10mg/L。

　　1.3.1.36种毒肽混合标准系列的配制。分别吸取50、100、200、400、600、1000μL，用初始流动相定容至10mL，配制成浓度为50、100、200、400、600、1000μg/L的标准系列工作液。

　　1.3.2样品前处理。

　　1.3.2.1提取。将新鲜野生菌样品烘干(烘干温度小于50℃)并打成粉末，精密称取干燥粉末0.2g，置于50mL离心管中，加入甲醇10mL，振荡涡旋1min，超声提取10min，以10000r/min离心10min后，移取上清液于另一离心管中。残渣中再加入10mL甲醇，涡旋混合均匀，再次超声提取10min后以10000r/min离心，合并上清液。40℃旋转蒸发近干，加2mL水溶解，洗涤3次，得提取液。

　　相关期刊推荐：《色谱》ChineseJournalofChromatography(月刊)1984年创刊，是专业性学术期刊，主要报道色谱学科的基础性研究成果、色谱及其交叉学科的重要应用成果及其进展，包括新方法、新技术、新仪器在各个领域的应用，以及色谱仪器与部件的研制和开发。适于科研院所等从事色谱基础和应用技术研究的科研人员、色谱及其相关学科的硕士及博士研究生、分析测试领域的基层科研人员、色谱仪器开发及经营单位的有关人员阅读。

　　1.3.2.2净化。分别用2mL甲醇和纯水淋洗活化PrimeOasisHLB固相萃取柱(3mL，60mg)，再将以上提取液过柱，用2mL含5%甲醇的水溶液淋洗2次，最后用2mL甲醇-乙腈混合溶液(V∶V=3∶2)洗脱。将洗脱液在40℃水浴中氮吹近干，用1mL初始流动相[甲醇-5mmol/L乙酸铵(0.1%甲酸)=90∶10]溶解定容，溶液过0.2μm滤膜后，待上机测定。

　　1.3.3分析条件。

　　1.3.3.1色谱条件。色谱柱为HSST3色谱柱(2.1mm×100mm，1.8μm，Waters公司);流动相A为5mmol/L乙酸铵-0.1%甲酸水溶液，B为甲醇溶液;柱温40℃;进样量1.0μL;洗脱程序见表1。

　　1.3.3.2质谱条件。电喷雾ESI正离子模式;多反应监测(MRM);离子源温度150℃;毛细管电压2.83kV;脱溶剂温度550℃;脱溶剂气流量1000L/h;其他质谱参数见表2。

　　2结果与分析

　　2.1质谱条件的优化鹅膏毒肽属双环八肽，鬼笔毒肽是一类环状七肽，其支链上有较多的羟基和甲基，容易接受电子而被离子化，故常采用正离子模式进行分析[6，12]。分别将6种毒肽的标准品用甲醇稀释成500ng/mL，质谱仪直接进样，在ESI正离子MS1Scan模式下，发现6种毒肽都有较强的M+1离子峰的出现，因此选定M+1为母离子，在DaughterScan模式下，分别找到每种毒肽的2个最佳子离子。最后优化锥孔电压、碰撞能、脱溶剂气流量、脱溶剂气温度等质谱参数，使离子化效率更高、离子强度最大。具体6种毒肽的母离子和子离子见表2。

　　2.2色谱条件的优化试验选择了UPLCHSST3色谱柱(2.1mm×100mm，1.8μm)，此色谱柱是与100%水相相兼容的C18柱，对保留和分离极性有机小分子具有较为理想的效果。该试验选择研究了4组流动相(A组水-乙腈;B组水-甲醇;C组0.1%甲酸水-甲醇;D组5mmol/L乙酸铵(0.1%甲酸)-甲醇)的分离效果，试验表明，甲醇的分离效果比乙腈好，且使用5mmol/L乙酸铵(0.1%甲酸)作为水相时，目标物的离子峰强度较高，峰形较好。6种毒肽的标准提取离子图详见图1

　　2.3样品前处理方法的优化由于野生菌中成分复杂，脂肪、磷脂、肽类等杂质含量较高，该试验采用了先溶剂提取、再固相萃取柱净化的方法，先后比较了甲醇、水、乙腈3种溶剂的提取效果，结果表明，甲醇的提取效果较好，回收率高。

　　试验考察了在使用HLB固相萃取柱净化过程中，5%甲醇-氯仿和5%甲醇-水淋洗液的淋洗效果，结果表明，5%甲醇-氯仿淋洗液对HLB小柱中吸附的脂肪、磷脂等杂质具有较好的洗脱效果，但回收率较差。综合考虑，该试验采用5%甲醇-水作为淋洗液。

　　2.4线性范围与检出限6种毒肽的线性方程、线性范围和线性相关系数见表3。以3倍信噪比(S/N≥3)估算检出限(LOD)，6种毒肽的检出限为30μg/kg。

　　2.5方法回收率和精密度取1份样品，分别对6种毒肽进行低(50μg/kg)、中(200μg/kg)、高(600μg/kg)浓度加标试验，结果发现(表4)，平均回收率分别为α-鹅膏毒肽99.5%～117.5%，β-鹅膏毒肽93.4%～107.0%，γ-鹅膏毒肽94.2%～110.1%，二羟鬼笔毒肽108.5%～119.8%，羧基二羟鬼笔毒肽93.5%～109.7%，羧基三羟鬼笔毒肽93.1%～106.5%;6次平行测定，变异系数(CV)在1.49%～7.77%。

　　2.6野生菌样品检测按上述方法对采集到的10个四川野生菌样品进行前处理和检测。在4号和6号样品中检出了α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽和二羟鬼笔毒肽3种毒蕈毒素，具体结果见表5，谱图见图2和图3。

　　3结论

　　该研究基于超高效液相色谱-质谱联用技术(UPLC-MS/MS)，采用甲醇提取，HLB固相萃取柱净化，HSST3色谱柱分离，电喷雾ESI正离子模式和多反应监测(MRM)方式对6种毒蕈毒素的目标离子进行监测，外标法定量，建立了6种毒蕈毒素的快速、准确、选择性好的测定方法。该方法与传统的色谱法的检测时间(20min)相比，大大缩短了检测时间，同时具备更高的准确度、灵敏度和特异性，适用于野生菌中毒肽毒素的测定。——论文作者：薛康1，2，胡江涛1，2*，俞凌云1，2，刘菲1，2，马丽1，2，龚婷婷1，2，华燚1，2，陈佳玥1，3