超高效液相色谱-串联质谱法快速测定毒蕈中6种鹅膏毒肽类和鬼笔毒肽类毒素

作者:快查重系统     发表时间:2021-10-21 09:26:59   浏览次数:76


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  摘要[目的]建立一种基于超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)快速测定野生毒蕈中6种鹅膏毒肽和鬼笔毒肽类毒素的分析方法。[方法]将采集的四川野生毒蕈子实体低温烘干,用甲醇超声提取,40℃旋转蒸发近干,加水复溶,OasisHLB固相萃取小柱净化,经WatersHSST3色谱柱分离,ESI正离子模式下多反应监测(MRM)方式分析。[结果]6种毒肽在50~1000μg/kg具有良好的线性关系,相关系数均大于0.99,方法检出限为30μg/kg。α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽、羧基三羟鬼笔毒肽在低、中、高3个浓度的平均回收率在93.1%~117.5%,变异系数(CV)在1.49%~7.77%。[结论]该方法能准确、灵敏地测定野生毒蕈中6种毒肽,适用于野生菌中毒肽毒素的测定。

  关键词野生毒蕈;鹅膏毒肽;鬼笔毒肽;超高效液相色谱-串联质谱法

  毒蕈即日常所说的毒蘑菇,是指不同类型的含有毒素的大型野生真菌,由于有些毒蕈在外观上与食用菌没有明显区别,导致误食毒蕈而引发中毒的事件时有发生,且在群体性食物中毒中,毒蕈中毒的致死率极高,其中肝损伤型毒蕈中毒致死率高达90%~100%[1]。据统计,我国毒蕈中毒事件中,95%是由鹅膏菌属引起的[2]。因为鹅膏菌中含有化学性质稳定且毒性极强的鹅膏多肽类毒素,该类毒肽耐高温、干燥和酸碱环境,一般的烹调加工不会破坏其毒性,不幸误食后,毒肽就会通过消化系统进入肝脏,对肝脏造成严重的损伤,最终引发多器官功能衰竭而死亡[3-5]。现阶段,国内外一般采用高效液相色谱法、高效液相色谱-飞行时间质谱法和高效液相色谱-串联质谱法检测毒肽毒素[6-11],我国还没有检测毒肽毒素的国家标准。因此,该研究建立了一种利用超高效液相色谱-串联质谱法快速测定野生毒蕈中6种毒肽毒素的检测方法,以期为野生菌毒素检测提供一种高效的检测方法。

  1材料与方法

  1.1仪器UPLClclass-XEVOTQ-XS超高效液相色谱-串联质谱联用仪(美国Waters公司);3H20RI离心机(中国赫西);AE240电子天平(瑞士梅特勒);XW-80A旋涡混合器(中国HUXI);B8510E-DTH超声波清洗器(美国必能信);Mili-QIntegral3超纯水仪(美国Millipore公司);ACQUITYUPLCHSST3色谱柱(2.1mm×100mm,1.8μm,美国Waters公司)。

  1.2试剂甲醇、乙腈、甲酸、乙酸铵、氯仿,HPLC级,美国Fisher公司。标准品:α-鹅膏毒肽(α-amanitin,纯度≥90%,瑞士Alex);β-鹅膏毒肽(β-amanitin,纯度≥90%,瑞士Alex);γ-鹅膏毒肽(γ-amaniyin,纯度≥90%,瑞士Alex);羧基三羟鬼笔毒肽(phallisacin,50μg/mL,上海安谱实验科技有限公司);羧基二羟鬼笔毒肽(phallacidin,纯度≥95%,瑞士Alex);二羟鬼笔毒肽(phalloidin,纯度≥90%,瑞士Alex)。1.3试验方法

  1.3.1标准溶液的配制。

  1.3.1.1α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽标准储备液的配制。分别精确称取α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟鬼笔5种标准物质1mg,精确至万分之一,甲醇定容至10mL,浓度为100μg/mL。-20℃存储。

  1.3.1.2鹅膏毒肽和鬼笔毒肽混合标准使用液的配制。分别准确吸取1.0mLα-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽和羧基二羟鬼笔毒肽储备液以及2.0mL羧基三羟鬼笔毒肽标准溶液于10mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,浓度为10mg/L。

  1.3.1.36种毒肽混合标准系列的配制。分别吸取50、100、200、400、600、1000μL,用初始流动相定容至10mL,配制成浓度为50、100、200、400、600、1000μg/L的标准系列工作液。

  1.3.2样品前处理。

  1.3.2.1提取。将新鲜野生菌样品烘干(烘干温度小于50℃)并打成粉末,精密称取干燥粉末0.2g,置于50mL离心管中,加入甲醇10mL,振荡涡旋1min,超声提取10min,以10000r/min离心10min后,移取上清液于另一离心管中。残渣中再加入10mL甲醇,涡旋混合均匀,再次超声提取10min后以10000r/min离心,合并上清液。40℃旋转蒸发近干,加2mL水溶解,洗涤3次,得提取液。

  相关期刊推荐:《色谱》ChineseJournalofChromatography(月刊)1984年创刊,是专业性学术期刊,主要报道色谱学科的基础性研究成果、色谱及其交叉学科的重要应用成果及其进展,包括新方法、新技术、新仪器在各个领域的应用,以及色谱仪器与部件的研制和开发。适于科研院所等从事色谱基础和应用技术研究的科研人员、色谱及其相关学科的硕士及博士研究生、分析测试领域的基层科研人员、色谱仪器开发及经营单位的有关人员阅读。

  1.3.2.2净化。分别用2mL甲醇和纯水淋洗活化PrimeOasisHLB固相萃取柱(3mL,60mg),再将以上提取液过柱,用2mL含5%甲醇的水溶液淋洗2次,最后用2mL甲醇-乙腈混合溶液(V∶V=3∶2)洗脱。将洗脱液在40℃水浴中氮吹近干,用1mL初始流动相[甲醇-5mmol/L乙酸铵(0.1%甲酸)=90∶10]溶解定容,溶液过0.2μm滤膜后,待上机测定。

  1.3.3分析条件。

  1.3.3.1色谱条件。色谱柱为HSST3色谱柱(2.1mm×100mm,1.8μm,Waters公司);流动相A为5mmol/L乙酸铵-0.1%甲酸水溶液,B为甲醇溶液;柱温40℃;进样量1.0μL;洗脱程序见表1。

  1.3.3.2质谱条件。电喷雾ESI正离子模式;多反应监测(MRM);离子源温度150℃;毛细管电压2.83kV;脱溶剂温度550℃;脱溶剂气流量1000L/h;其他质谱参数见表2。

  2结果与分析

  2.1质谱条件的优化鹅膏毒肽属双环八肽,鬼笔毒肽是一类环状七肽,其支链上有较多的羟基和甲基,容易接受电子而被离子化,故常采用正离子模式进行分析[6,12]。分别将6种毒肽的标准品用甲醇稀释成500ng/mL,质谱仪直接进样,在ESI正离子MS1Scan模式下,发现6种毒肽都有较强的M+1离子峰的出现,因此选定M+1为母离子,在DaughterScan模式下,分别找到每种毒肽的2个最佳子离子。最后优化锥孔电压、碰撞能、脱溶剂气流量、脱溶剂气温度等质谱参数,使离子化效率更高、离子强度最大。具体6种毒肽的母离子和子离子见表2。

  2.2色谱条件的优化试验选择了UPLCHSST3色谱柱(2.1mm×100mm,1.8μm),此色谱柱是与100%水相相兼容的C18柱,对保留和分离极性有机小分子具有较为理想的效果。该试验选择研究了4组流动相(A组水-乙腈;B组水-甲醇;C组0.1%甲酸水-甲醇;D组5mmol/L乙酸铵(0.1%甲酸)-甲醇)的分离效果,试验表明,甲醇的分离效果比乙腈好,且使用5mmol/L乙酸铵(0.1%甲酸)作为水相时,目标物的离子峰强度较高,峰形较好。6种毒肽的标准提取离子图详见图1

  2.3样品前处理方法的优化由于野生菌中成分复杂,脂肪、磷脂、肽类等杂质含量较高,该试验采用了先溶剂提取、再固相萃取柱净化的方法,先后比较了甲醇、水、乙腈3种溶剂的提取效果,结果表明,甲醇的提取效果较好,回收率高。

  试验考察了在使用HLB固相萃取柱净化过程中,5%甲醇-氯仿和5%甲醇-水淋洗液的淋洗效果,结果表明,5%甲醇-氯仿淋洗液对HLB小柱中吸附的脂肪、磷脂等杂质具有较好的洗脱效果,但回收率较差。综合考虑,该试验采用5%甲醇-水作为淋洗液。

  2.4线性范围与检出限6种毒肽的线性方程、线性范围和线性相关系数见表3。以3倍信噪比(S/N≥3)估算检出限(LOD),6种毒肽的检出限为30μg/kg。

  2.5方法回收率和精密度取1份样品,分别对6种毒肽进行低(50μg/kg)、中(200μg/kg)、高(600μg/kg)浓度加标试验,结果发现(表4),平均回收率分别为α-鹅膏毒肽99.5%~117.5%,β-鹅膏毒肽93.4%~107.0%,γ-鹅膏毒肽94.2%~110.1%,二羟鬼笔毒肽108.5%~119.8%,羧基二羟鬼笔毒肽93.5%~109.7%,羧基三羟鬼笔毒肽93.1%~106.5%;6次平行测定,变异系数(CV)在1.49%~7.77%。

  2.6野生菌样品检测按上述方法对采集到的10个四川野生菌样品进行前处理和检测。在4号和6号样品中检出了α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽和二羟鬼笔毒肽3种毒蕈毒素,具体结果见表5,谱图见图2和图3。

  3结论

  该研究基于超高效液相色谱-质谱联用技术(UPLC-MS/MS),采用甲醇提取,HLB固相萃取柱净化,HSST3色谱柱分离,电喷雾ESI正离子模式和多反应监测(MRM)方式对6种毒蕈毒素的目标离子进行监测,外标法定量,建立了6种毒蕈毒素的快速、准确、选择性好的测定方法。该方法与传统的色谱法的检测时间(20min)相比,大大缩短了检测时间,同时具备更高的准确度、灵敏度和特异性,适用于野生菌中毒肽毒素的测定。——论文作者:薛康1,2,胡江涛1,2*,俞凌云1,2,刘菲1,2,马丽1,2,龚婷婷1,2,华燚1,2,陈佳玥1,3

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